染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation），是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子等蛋白與DNA之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)方法之一。在活細(xì)胞內(nèi)使用甲醛將DNA和蛋白交聯(lián)，使用超聲將染色質(zhì)切成很小的片斷，并沉淀下來(lái)。通過(guò)目的蛋白的抗體將蛋白免疫共沉淀，富集。通過(guò)定量PCR檢測(cè)使用特異性引物對(duì)蛋白可能結(jié)合的DNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)流程：
1、細(xì)胞交聯(lián)與超聲破碎
1 將細(xì)胞培養(yǎng)在15cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)到70%融合度時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行細(xì)胞處理。培養(yǎng)到指定時(shí)間點(diǎn)后，去除培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的PBS洗一次后將細(xì)胞消化下來(lái)后轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心去除上清，加入5ml PBS緩沖液，加入甲醛至終濃度為1%，室溫置于搖床上輕輕晃動(dòng)20min。加入2.5M Glycine至終濃度0.125M終止交聯(lián)。在4℃下輕輕晃動(dòng)10min。在100g，4℃離心5min。棄上清，加入10ml 預(yù)冷的PBS洗兩次，離心去除上清。
2 加入2 ml cell Lysis Buffer（含2.5 μl 蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞。冰上孵育15min，每隔5min振蕩一下細(xì)胞懸液。孵育之后，用Dounce勻漿器將細(xì)胞懸液勻漿化10次以促進(jìn)核釋放。
3 4℃ 800 g離心5 min。去除上清，用0.5 ml Nuclear Lysis Buffer（含2.5μl蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞。
4 超聲破碎：使用超聲儀在中檔，沖擊13s，冰上放置45s，共6次。取5μl細(xì)胞裂解液進(jìn)行電泳檢測(cè)未打斷的DNA。
5 4℃ 12000rpm離心10 min除去不溶解的沉淀。將上清液轉(zhuǎn)移至心的EP管中，分為50μl一份。
2、免疫共沉淀
1每個(gè)IP實(shí)驗(yàn)需要450μl Dilution Buffer和2.25μl蛋白酶抑制劑。測(cè)試樣品包括：陽(yáng)性對(duì)照Anti-Histone H3，陰性對(duì)照Normal Rabbit IgG，目的抗體。
2 超聲好的50μl樣本置于冰上，加入450μl稀釋液（含2.25μl蛋白酶抑制劑），輕輕混勻后，去除5μl凍存，作為input。
3 分別加入不同抗體和20μl混勻的protein A magnetic beads。
陽(yáng)性對(duì)照抗體，4.0 μg抗體每管。
陰性對(duì)照IgG，5.0 μg抗體每管。
目的抗體，每管加5.0 μg抗體。
4 4℃旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜。
5 使用磁力架將Protein A magnetic beads沉淀下來(lái)，輕輕去除上清。
6 加入0.5ml預(yù)冷的緩沖液，在旋轉(zhuǎn)臺(tái)上孵育5min后置于磁力架上，去除上清。
7 低鹽清洗緩沖液、高鹽清洗緩沖液、LiCl清洗緩沖液、TE緩沖液分別洗1次，每次5min。將樣本置于磁力架上，去除上清。
8 洗脫P(yáng)rotein/DNA復(fù)合物和反交聯(lián)Protein/DNA復(fù)合物為單獨(dú)的DNA。
9 加入100μl ChIP清洗緩沖液，62℃振蕩孵育2 h
10 95℃孵育10 min。然后將樣品置于室溫冷卻。
11 將樣本置于磁力架上，將上清液移到一個(gè)新的管子中。
3、DNA純化
1 將0.5 ml Bind Reagent A加入每個(gè)100 μl的DNA樣品管中并混勻。將樣本轉(zhuǎn)移至離心柱上管中，12000rpm離心1min。去除下管液體。
2 加入0.5 ml Wash Reagent至離心柱上管中，12000rpm離心1min。去除下管液體。
3 12000rpm離心2min。丟棄下管。將上管置于新的管中，在離心柱上加入50μl Elution buffer，常溫放置2min，12000rpm離心1min。
4 去除離心柱，下管加入20μl洗脫液就是純化的DNA，直接用于定了PCR檢測(cè)或存于-20℃。
4、定量PCR檢測(cè)
1 使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純化DNA含量
2 PCR體系：
試劑 | 體積 |
DNA | 2µL |
PCR上游引物（10µM） | 0.4 µL |
PCR下游引物（10µM） | 0.4 µL |
SYBR Green solution | 10 µL |
滅菌雙蒸水 | 7.2 µL |
總量 | 20 µL |
3 定量PCR檢測(cè)
反應(yīng)條件：
95.0 ℃ | 10min |
|
95.0 ℃ | 15 s | 40 cycles |
60.0 ℃ | 1min |
95.0 ℃ | 15 s | melt curve |
60.0 ℃ | 1 min |
95.0 ℃ | 15 s |
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例：
圖 ChIP檢測(cè)結(jié)果示例圖
A ChIP檢測(cè)DNA跑膠示例圖。B ChIP檢測(cè)結(jié)果分析示例圖。C ChIP檢測(cè)擴(kuò)增曲線示例圖。D ChIP檢測(cè)溶解曲線示例圖。
