熒光素酶報告實驗由于其快捷、廉價、靈敏度高和可定量等優(yōu)點，已普遍用于細胞生物學的研究，如基因表達轉(zhuǎn)錄水平的研究。熒光素酶報告系統(tǒng)屬于生物發(fā)光系統(tǒng)，其中的熒光素酶來自于不同生物體內(nèi)的氧化酶，很多物種（細菌、海洋動物、昆蟲等）中都含有熒光素酶，其中應用比較廣泛的是熒火蟲熒光素酶。它可以在一定條件下與底物發(fā)生化學反應產(chǎn)生可檢測到的光，產(chǎn)生光的過程中幾乎不產(chǎn)生熱量，也就是說這個過程中幾乎所有的能量全部轉(zhuǎn)化為光能，這使得檢測的靈敏度非常高。下面以報告基因?qū)嶒灒▎幼樱槔�，來介紹雙熒光素酶報告系統(tǒng)。
熒光素酶反應原理
報告基因?qū)嶒灣Ｓ糜谘芯磕康幕虻恼{(diào)控元件（啟動子、增強子等），調(diào)控元件的DNA結(jié)合域和順式作用元件實現(xiàn)共價結(jié)合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。整個報告基因的核心是將待定的調(diào)控元件與報告基因進行融合，檢測報告基因的表達。由于報告基因的表達完全取決待定的調(diào)控元件，故報告基因的表達量與待定調(diào)控元件的活性直接相關。一個好的報告基因必須滿足以下條件：
（1）在所檢測的細胞內(nèi)不存在；
（2）檢測起來非常方便；
（3）靈敏度要高，最好可以定量。相比于傳統(tǒng)的β-半乳糖苷酶（LacZ，真核生物內(nèi)有內(nèi)源性干擾）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT，檢測復雜）、熒光蛋白（GFP、YFP、RFP等，靈敏度不高，有些細胞有自發(fā)熒光現(xiàn)象），熒光素酶檢測系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)勢。
熒光素酶報告實驗圖解
由于熒光素酶超級靈敏的能力和寬廣的動力學范圍，熒光素酶系統(tǒng)得到了廣泛的使用。通常熒光素酶的實驗會將待檢測的調(diào)控元件（啟動子）安排在熒光素酶基因的上游，構(gòu)建成載體，然后將構(gòu)建完成的載體導入到合適的動物細胞中，通過檢測熒光素酶的活性來判斷調(diào)控元件的活性。
在熒光素酶報告系統(tǒng)中，只使用一種熒光素酶（一般為熒火蟲熒光素酶），為單熒光素酶報告實驗；由于不同的熒光素酶所發(fā)出的光具有不同的光譜性質(zhì)，或使用不同的底物，一個報告實驗中也可以使用兩種或多種熒光素酶，其中最常用到的就是雙熒光素酶（一般為熒火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶）報告實驗，其中一種熒光素酶作為報告基因，另一種則作為內(nèi)參，主要作用是減少外界因素對于實驗數(shù)據(jù)產(chǎn)生的影響，這些影響主要包括操作誤差、細胞接種差異、細胞處理的誤差、孔間增殖差異等因素。因此，在調(diào)控元件（啟動子、增強子）的研究中，雙熒光素酶報告實驗應用的會更多一些，整個的實驗過程也非常的簡便，如下圖所示。
熒光素酶報告實驗流程
